TERAPIA EPIGENÓMICA

 LINFOMA 

Tema: Inhibidores de la histona desacetilasa y regulación epigenética en neoplasias linfoides

Mecanismo epigenómico tratado: Acetilación de histonas 

Como se lo hizo: 

- Catalizado por histonas acetiltransferasas (HAT) e histonas desacetilasas (HDAC). Los HAT utilizan Co-A como cofactor para acetilar residuos de arginina (R) o lisina (K)

- Uso de inhibidores de HDAC: romidepsina, belinostat, chidamida, givinostat y ácido valproico

Resultados: 

- La disminución de la actividad de HAT causada por deleciones de genes y mutaciones somáticas, conduce a estados de cromatina reprimidos relacionados con procesos malignos en neoplasias linfoides

- La actividad de HDAC alterada, puede influir en la expresión génica, como en otros procesos celulares, incluida apoptosis en células tumorales, la detención del crecimiento, la diferenciación y la inhibición de la angiogénesis.

- La acetilación de histonas a menudo proceden o acompañan a transformaciones malignas

REFERENCIA BIBLIOGRÁFICA: 

https://link.springer.com/article/10.1007/s10637-015-0290-y

Técnicas de edición de Ácidos Nucleicos en LINFOMA

El sistema CRISPR/Cas9 es la herramienta de edición de genes más poderosa hasta ahora

Tipo de edición: In vivo de células somáticas 

Dirigido hacia:  ARN guía único (ARNsg)

Dirigido por: ARN: CRISPR-Cas9

Vector: Lentivirus basado en plásmidos que expresan sgRNA 

Célula a tratar: Células de Linfoma de Burkitt (células B)

Vía de administración: Parenteral: Intravenosa

RESULTADOS

Costo plazo: El tratamiento inhibe la proliferación de células de linfoma e induce la apoptosis de células infectadas con el virus Epstein-Barr

Mediano plazo: La entrega de CRISPR-Cas9 mediada por lentivirus ha logrado resultados exitosos tanto in vitro y en vivo, para el tratamiento de distintos virus 

Largo plazo:  CRISPR-Cas9 se ha convertido en una herramienta revolucionaria de edición del genoma, se espera que exprese mayor eficacia en terapias antitumorales en células de linfoma

Estrategias para editar genes utilizando el sistema CRISPR/Cas9

REFERENCIA BIBLIOGRÁFICA: 

https://sci-hub.se/https://doi.org/10.1016/j.jconrel.2017.09.012 

Terapia Regenerativa (Terapia Celular o Terapia con Stem Cells)

Terapia con células CAR-T anti CD19 en LINFOMA

Tipo de Stem Cells: Células CAR-T (células T con receptor de antígeno quimérico) 

Método de obtención:

1. Extracción de sangre del paciente diagnosticado con Linfoma y la posterior separación de linfocitos T de esta muestra 

2. Luego se realiza la trasferencia del gen que codifica para la construcción del antígeno quimérico al genoma del linfocito T (se lo hace por medio de transfección con el uso de vectores virales, como retrovirus o por medio de otros mecanismos como la electroporación)

Vía de administración: Se inyectan al paciente, luego de realizarle una quimioterapia de acondicionamiento.

RESULTADOS: 

A corto plazo: No presentaron cambios en los niveles de estas células ni desarrollaron infecciones que pudieran hacer sospechar su depleción

A mediano plazo: La infiltración exitosa de las células CAR T en los ganglios linfáticos malignos consiguieron una respuesta completa del tratamiento sin la necesidad de una tercera infusión.

A largo plazo: A pesar de que el paciente sufrió una aplasia de células B prolongada a causa de la muerte de todas las células que presentaran el antígeno CD19, no tuvo ninguna toxicidad crónica.

Referencias:

1. http://scielo.sld.cu/pdf/hih/v34n4/a03_923.pdf

2.  https://link.springer.com/article/10.1007%2Fs11899-018-0476-4

Transgénicos en LINFOMA

 TEMA: EVALUACIÓN DE LA ACTIVIDAD ANTITUMORAL DE CÉLULAS MADRE MESENQUIMALES QUE SOBREEXPRESAN TRAIL E IFNβ EN UN MODELO MURINO DE LINFOMA

TIPO DE ANIMAL TANSGÉNICO: Ratones de la cepa Balb/c machos de 6 a 8 meses(murinos)

MÉTODO POR EL QUE FUE OBTENIDO: Se tomó 1 ml de células del Linfoma Murino L5178Y por punción peritoneal de un ratón con linfoma ascítico, de forma estéril, se lavaron y centrifugaron 3 veces con 5 ml de Solucion Balanceada de Hanks´s estéril a 1500 rpm. Se concentraron las células de linfoma en una suspensión de 1x107 /ml de Solución Balanceada de Hanks´s estéril y se inocularon 100 µl de la suspensión celular en los ratones en distintos lugares anatómicos tanto subcutáneos (espalda, pierna y el costado) como intramusculares (músculo gastrocnemio y sacrocaudal ventral), para valorar la mejor zona que nos permitiera evaluar el desarrollo del tumor y realizar las pruebas fisiológicas e inmunológicas. Para determinar el estado de inmunosupresión de los ratones; por cada zona se utilizaron 4 ratones.

USO QUE SE LE HA DADO: Para determinar si la Respuesta Inmune de tipo Celular, en este modelo de inmunosupresión por el Linfoma Murino.Este modelo de Linfoma sólido es bueno para estudiar los mecanismos biológicos del desarrollo tumoral y sus interacciones con los sistemas del individuo, además de probar fármacos de interés para valorar sus propiedades inmunoestimuladoras o citotóxicas, así como quimioterapéuticas.

TRANSGÉNICOS

VENTAJAS

1   1. De gran utilidad para fabricar medicamentos en distintas enfermedades.

     2. Los animales transgénicos (ratones) tienen una mayor gamma de nutrientes en su carnes.

     3. Importantes para desarrollar terapias génicas.

     4. La modificación genética de estos animales puede aumentar su resistencia a ciertas enfermedades y plagas.

     5. Los animales transgénicos pueden volverse donadores en potencia en trasplantes de órganos.

DESVENTAJAS

1. Algunos animales no deben ser usados para este tipo de experimentaciones.

2.  La modificación genética en animales puede conllevar a la pérdida de su biodiversidad genética.

3. Los humanos que reciben trasplantes de animales pueden ser susceptibles a enfermedades que solo se dan en estos últimos.

4.  Los animales sufren ciertos tipos de maltrato en este proceso de experimentación.

5. Animales transgénicos al ser sueltos en la naturaleza pueden desarrollar problemas entre sí.

       Referencias bibliográficas:  

     1. http://eprints.uanl.mx/16853/1/1080290391.pdf

   2. https://www.ecorfan.org/bolivia/researchjournals/Ciencias_de_la_Salud/vol4num10/Revista_Ciencias_de_la_Salud_V4_N10_3.pdf

ADN Recombinante artificial en LINFOMA

T: Clonación del Gen EBER-1 Virus Epstein-Barr y su expresión génica en linfomas 

O:	Determinar la presencia de transcriptos virales en linfomas, conociendo que el virus de Epstein Barr es capaz de inducir transformación, realizando screening de los recombinantes.
G:	Fragmento de ADN de hasta 10 Kb de BamHI C de la cepa B95-8 que contiene el gen EBER-1
ER:	EcoRI
EL:	Ligasa T4 (Sigma)
V:	Plásmido recombinante pBR322, pBSEBER-1  (150pb) (no viral)
CR:	Procariota (E.coli Top 10) Células neoplásicas (eucariota)
MTG:	Transformación y transfección por temperatura de 55° C
MIC:	Cultivo de las células (microbiológicos), Screening de color, hibridación y PCR

Referencia Bibliográfica: 

1. https://www.redalyc.org/jatsRepo/1805/180550477003/html/index.html

2. https://conganat.uninet.edu/IIICVHAP/comunicaciones/092/index.htm

Ejemplo de recombinación de ácidos nucleicos en la naturaleza 

Este se recombina de manera natural por procesos como la infección viral reproducción sexual y la transformación bacteriana. En el caso de las bacterias existen tres mecanismos de recombinación: transformación, conjugación y transducción. (1)

Por ejemplo, los virus como es el caso del Epstein-Barr, transfieren su ADN envuelto en una cubierta con proteínas, entre bacterias, especies de eucariotas o virus, transfieren su material genético durante la infección. Dentro de la célula infectada, los genes se replican y dirigen la síntesis de proteínas virales. (2)

Referencia Bibliográfica: 

1. https://cdn.educ.ar/dinamico/UnidadHtml__get__3115e6c3-7a08-11e1-805a-ed15e3c494af/index.html

2. https://www.ucm.es/data/cont/media/www/pag-56185/19-La%20recombinaci%C3%B3n%20gen%C3%A9tica%20en%20procariontes.pdf

Técnica de Hibridación (FISH)

En Linfoma B difuso de célula grande (LBDCG)

 La FISH utiliza fragmentos de ADN incorporados con nucleótidos acoplados a fluoróforos (sondas) para examinar la presencia o la ausencia de secuencias complementarias, para el análisis de esta técnica se uso sondas Break Apart y se necesitaron muestras de medula ósea y sangre periférica en la que se observaron los núcleos en tejidos con zona tumoral. (1)

El diagnostico y pronostico de linfoma B difuso de célula grande (LBDCG), fue el correspondiente a esta prueba y se reconoció resultados positivos: el 24% para Bcl-2, el 23% para c-MYC, el 12,5% para Bcl-6, el 8% de positividad de Bcl-2/cMYC y el 5% presentaron positividad para Bcl-2/Bcl-6. (1) (2)

A. FISH Bcl-6 negativo. Los núcleos muestran dos señales de fusión (amarilla) normal. B. FISH Bcl-2 positivo. Los núcleos muestran una señal de fusión, una verde y una roja independientes correspondientes a rearreglos de gen. C. FISH c-MYC positivo. Los núcleos muestran una señal de fusión, una verde y una roja independientes correspondientes a rearreglos de gen.

Estadísticas de prueba FISH en diversos Linfomas

Referencias Bibliográficas:

1. http://www.scielo.org.co/pdf/rcc/v23n1/0123-9015-rcc-23-01-3.pdf

2. http://www.sah.org.ar/revista/numeros/28-vol%2019-extraordinario.pdf

Reacción en cadena de la polimerasa (PCR) en LINFOMA

Es una prueba de ADN de alta sensibilidad que puede detectar cambios genéticos y ciertos cambios cromosómicos tan pequeños que no se pueden ver con un microscopio, incluso si la muestra tiene muy pocas células de linfoma. (1)

El analisis de clonalidad mediante PCR se basa en la amplificación simultanea de todos los reordenamientos presentes en la muestra (clonales y policlonales). La detección de estos reordenamientos para el gen IgH está basada en el uso de cebadores FR que presentan un 80% de hemología con las regiones V, por ejemplo: los cebadores para la región FR2 y FR1 del segmento VH disminuye el porcentaje de falsos negativos. (1) (2)

 Estructura del gen IgH y localización de los cebadores para amplificar los reordenamientos del gen

Muchas translocaciones han sido descritas que pudieran tener utilidad diagnóstica o pronóstica en los LNH. Estas translocaciones involucran genes como Bcl-1, Bcl-2, Bcl-3, Bcl-6, AP12, PAX-5 y NPM/ALK. Las cuales pueden detectarse con PCR. (2) 

El uso de PCR en este tipo de muestras ha demostrado poder tener un importante valor adjunto en el diagnostico del Linfoma, ayudando a distinguir entre lesiones benignas y neoplásicas. (3)

Referencias Bibliográficas:

1. http://scielo.sld.cu/scielo.php?script=sci_arttext&pid=S0864-02892008000100002

2. https://www.medigraphic.com/pdfs/imss/im-2015/im151m.pdf

3. https://www.cancer.org/es/cancer/linfoma-hodgkin/deteccion-diagnostico-clasificacion-por-etapas/como-se-diagnostica.html

Alteraciones de la Epigenómica en el LINFOMA

 Las alteraciones epigenéticas se consideran mecanismos independientes que participan en la aparición y progresión del cáncer. Estos mecanismos epigenómicos no implican un cambio en la secuencia de ADN, pero si tienen una importante modificación en la expresión génica. (1)

En el Linfoma, estas alteraciones corresponden principalmente a la hipermetilación de los promotores de los genes supresores tumorales, hipometilación global del DNA, junto con la sobreexpresión y actividad de las histonas-desacetilasas. En células neoplásicas, la abundancia de las histonas desacetiladas se asocia genrealmente con la hipermetilación del ADN y silenciamiento de genes. (2)

En un estudio realizado en células de manto del Linfoma se mostraba una hipometilación del ADN exclusiva en este sitio, que expresaba el oncogén SOX11, sino tambien marcas de histonas relacionadas con regiones reguladoras activas tipo enhacer, para ello se estudio la estructura tridimensional del ADN mediante la técnica de 4C-seq. (3)

Referencias bibliográficas:

1.https://www.elsevier.es/es-revista-gaceta-mexicana-oncologia-305-articulo-las-alteraciones-epigeneticas-progresion-del-X1665920114579068

2.https://www.medigraphic.com/pdfs/circir/cc-2012/cc125o.pdf

3.https://genotipia.com/genetica_medica_news/epigenoma-del-linfoma/

Alteraciones de la Traducción en el LINFOMA

La biología de las células normales y cancerosas ha estudiado a la familia de los genes MYC en Linfomas, es una de las mas ampliamente estudiadas en la biología; esta constituida por los protooncogenes c.Myc, N-Myc y L-Myc, que están íntimamente relacionadas con neoplasias de este tipo.

El gen c-Myc se compone de tres exones. El exón 1 tiene dos promotores y no codifica. Los exones 2 y 3 codifican para la proteína Myc que tiene un sitio de inicio para la traducción en el nucleótido 16 del exón 2 (20); en dicho sitio se sintetiza una proteína c-Myc de 64 kDa constituida por 439 aminoácidos y presenta una traducción alternativa que origina dos tipos de proteínas, una de secuencia larga y otra de secuencia corta, denominadas p67 Myc (67 kDa) y MycS (45 kDa). (1)(2)

Los errores en la traducción, que se asocian con el origen del Linfoma en células de manto tienen un proceso evolutivo en el que las células normales adquieren un fenotipo maligno a partir de la acumulación de diversas alteraciones genéticas y epigenéticas que afectan a protooncogenes, genes supresores de tumores y genes de reparación del ADN. (3)

Referencias Bibliográficas: 

1. http://www.scielo.org.co/scielo.php?script=sci_arttext&pid=S0121-07932011000400006

2.https://www.sciencedirect.com/science/article/abs/pii/S0037196311000461

3. http://scielo.isciii.es/scielo.php?script=sci_arttext&pid=S0212-71992007000300010

Alteraciones de la transcripción en el Linfoma

 Científicos han logrado, en gran medida, comprender mejor cómo ciertos cambios en el ADN pueden causar que los linfocitos normales se conviertan en células de linfoma. (1)

Algunas personas heredan mutaciones del ADN de uno de sus padres que aumentan sus riesgos para algunos tipos de cáncer. Tener antecedentes familiares de linfoma (linfoma de Hodgkin, linfoma no Hodgkin, CLL) parecen aumentar su riesgo de linfoma.

Se sabe que el mecanismo de transcripción de esta enfermedad es el plásmido recombinante pBSEBER-1, obtenido con el procedimiento de clonación, se usó para sintetizar ARN antisentido corriente, arriba del promotor T7 (transcripción dirigida por el promotor T7). (2)(3)

Referencias Bibliográficas: 

1. https://www.sciencedirect.com/science/article/abs/pii/S1636541012611386

2. http://www.scielo.org.pe/scielo.php?script=sci_arttext&pid=S1726-46341999000100007

3. https://www.cancer.org/es/cancer/linfoma-no-hodgkin/causas-riesgos-prevencion/que-lo-causa.html